伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量的影响和作用时相的研究

发布时间：2017-08-23 08:22

  本文关键词：伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量的影响和作用时相的研究

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【摘要】：目的： 研究伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar typhi, S.typhi）质粒pR_(ST98)对巨噬细胞自噬动态过程的影响，探讨该质粒与沙门菌感染时巨噬细胞自噬体及自噬溶酶体的关系，揭示pR_(ST98)对自噬通量（autophagic flux）的作用时相，为通过调控细胞自噬水平来防治细菌感染的新策略及新药研发提供理论和实验依据。 方法： 一、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬的影响 以携带pR_(ST98)的伤寒沙门菌野生株ST8，消除pR_(ST98)的伤寒沙门菌突变株ST8-ΔpR_(ST98)和将pR_(ST98)经接合转移重新导入ST8-ΔpR_(ST98)所获得的回补株ST8-c-pR_(ST98)，按感染复数（multiplicity of infection，MOI）100:1感染小鼠腹腔巨噬细胞J774A.1，建立细胞感染模型，同时设自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）干预组。分别于细胞感染后1~3h收集细胞，透射电镜（transmission electronmicroscope，TEM）观察细胞超微结构；流式细胞术（flow cytometry，FCM）和免疫印迹法（western blot，WB）检测自噬蛋白LC3-II、Beclin-1的表达；用红色和绿色荧光蛋白偶联的LC3真核细胞表达载体mRFP-GFP-LC3瞬时转染巨噬细胞，共聚焦激光显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）观察LC3-II点状聚集，并用免疫组化法做平行对照；平板菌落计数法检测胞内活菌数（colony-forming unit，CFU）。 二、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量及作用时相的影响 由于伤寒沙门菌的严格宿主特异性，使其缺乏理想的动物模型，为今后进一步在动物活体内研究pR_(ST98)与细胞自噬的关系，本部分实验用与伤寒沙门菌有非常近缘关系的鼠伤寒沙门菌作为研究对象，研究该质粒对巨噬细胞自噬通量的影响。以携带一分子量为100kb毒力质粒的鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium）标准毒株χ~(3306)、将其质粒消除后获得的鼠伤寒沙门菌突变株χ~(3337)和将质粒pR_(ST98)经接合转移导入χ~(3337)后形成的鼠伤寒沙门菌接合子χ~(3337)/pR_(ST98)为受试菌，同第一部分建立感染模型。分别设饥饿诱导组（无血清RPMI1640培养液处理细胞）、溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）干预组和常规细胞感染模型组。于感染后1h收集细胞，用Giemsa染色法观察各感染组细胞状态及感染情况；CLSM观察转染mRFP-GFP-LC3的巨噬细胞内自噬蛋白LC3-II的点状聚集；WB检测自噬标记蛋白LC3-II及自噬底物蛋白p62的表达；将荧光素酶报告基因lux导入以上3株受试菌染色体，获得发光菌χ~(3306)lux、χ~(3337)lux及χ~(3337)/pR_(ST98)lux，用小动物成像仪检测相应细菌的生物发光量，直接分析感染细胞内CFU。 结果： 一、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬的影响 （1）TEM结果显示，感染后1~3h，ST8-ΔpR_(ST98)感染组细胞中可观察到典型的自噬体和自噬溶酶体；ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染组少见或未见到上述结构，但可见大量细菌的存在。 （2）CLSM检测LC3点状结构统计结果显示，感染后1h，ST8-ΔpR_(ST98)感染组细胞内LC3点状结构数量明显高于ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染组（p0.05）；RAPA干预后，ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染组细胞内点状结构均有增加（p0.05），但各感染组之间无显著差异。 （3）FCM和WB检测结果显示，感染后1h，ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染组细胞自噬蛋白LC3-II和Beclin-1的表达量均低于ST8-ΔpR_(ST98)感染组（p0.05）；RAPA干预后，ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染组LC3-II、Beclin-1的表达量均增加（p0.05），但各感染组之间无显著差异。 （4）平板菌落计数法计数胞内CFU结果显示，感染后1h，ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染组胞内CFU高于ST8-ΔpR_(ST98)感染组（p0.05）；RAPA干预后，趋势不变。感染后3h，RAPA干预的ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染组胞内CFU减少均低于未干预组（p0.05），而ST8-ΔpR_(ST98)感染组未见显著变化。 二、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量及作用时相的影响 （1）Giemsa染色结果显示，感染后1h，常规感染组细胞内未见或少见空泡，所见空泡内常包裹细菌；CQ干预后，细胞质中呈现均匀空泡，细胞略有肿胀，各感染组胞内细菌增多；饥饿诱导下，巨噬细胞内出现不均匀的空泡，胞内细菌量低于未诱导组。 （2）CLSM检测结果显示，感染后1h，χ~(3337)感染组细胞内黄色荧光聚集结构（自噬体）多于χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染组，CQ干预后黄色荧光差异更加显著；红色荧光聚集结构（自噬溶酶体）则未见明显差异；饥饿诱导后，χ~(3337)感染组平均每个细胞中自噬体显著多于χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染组（p0.01），，自噬溶酶体各感染组差别无统计学意义。 （3）WB检测结果显示，感染后1h，χ~(3337)感染组细胞LC3-II表达量高于χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染组，而p62表达量则低于后两组；CQ干预后，各组感染细胞LC3-II表达差异与常规感染模型一致，即χ~(3337)感染组细胞高于χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染组，但差异更加显著，p62表达水平各感染组间差异不显著。 （4）小动物成像仪检测胞内CFU结果显示，感染后1h，χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染组胞内CFU显著高于χ~(3337)感染组（p0.05）；CQ干预后，各感染组胞内CFU无显著差异。饥饿诱导后，χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染组胞内CFU均低于未诱导对照组（p0.01）。 结论： 1.伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)可抑制巨噬细胞自噬水平，促进细菌增殖。 2.伤寒沙门菌质粒pR_(ST98)对巨噬细胞自噬通量的作用时相为自噬动态过程的早期阶段，即自噬体形成阶段。 3.携带质粒pR_(ST98)的沙门菌感染巨噬细胞时，用药物上调细胞自噬活性，可抑制细菌增殖，减轻感染。
【关键词】：伤寒沙门菌 质粒 巨噬细胞 自噬通量
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.22
【目录】：

• 中文提要4-7
• Abstract7-11
• 引言11-14
• 第一部分 伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬的影响14-26
• 1 材料与方法15-20
• 2 结果20-26
• 第二部分 伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬通量及作用时相的影响26-39
• 1 材料与方法27-29
• 2 结果29-36
• 3 讨论36-39
• 参考文献39-42
• 综述 伤寒沙门菌动物模型研究进展42-48
• 参考文献46-48
• 攻读硕士学位期间已发表和待发表的论文48
• 本课题所获基金资助48-49
• 英文缩略词表49-50
• 致谢50-51

【参考文献】

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1 吴淑燕;李琼;储元元;李Z脑

本文编号：723981