pNL-hHGF-EGFP慢病毒载体的构建、鉴定及表达

发布时间：2017-08-24 05:50

  本文关键词：pNL-hHGF-EGFP慢病毒载体的构建、鉴定及表达

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【摘要】：目的： 构建含人肝细胞生长因子（human hepatocyte growth factor， hHGF）基因的慢病毒载体，检测hHGF基因的mRNA和蛋白在293T细胞中的表达情况，为研究hHGF基因的功能奠定基础。 方法： 1．选择合适的酶切位点，将hHGF cDNA基因片段（包含有启动子和多聚腺苷酸A尾）从pUC-SRα-HGF载体酶切获取，平端连接入慢病毒载体pNL-EGFP，，构建重组慢病毒载体pNL-hHGF-EGFP。 2．将pNL-hHGF-EGFP转染293T细胞，应用RT-PCR、ELISA方法检测hHGF基因在293T细胞中的表达。 3．将pNL-hHGF-EGFP与辅助质粒pHELPER、 pVSVG以一定比例共转染293T细胞，收集48h、72h病毒上清，经超滤浓缩后，测定病毒滴度，获得高滴度慢病毒颗粒。 结果： 1．hHGF cDNA基因片段正确的克隆到pNL-EGFP慢病毒载体上，电泳结果和酶切鉴定均能得到与理论大小相符合的片段，测序结果与Genebank序列完全一致。 2．pNL-hHGF-EGFP转染293T细胞后绿色荧光蛋白有表达，转染24后RT-PCR检测到转染的293T细胞中hHGF基因mRNA表达，转染48h后细胞上清中HGF蛋白含量为52.72±13.09ng/ml。 3．三质粒共转染293T细胞成功获得慢病毒，测得病毒的滴度为1.5×106TU/ml。 结论： 1．成功地构建了含有人HGF基因的慢病毒载体。 2．pNL-hHGF-EGFP是具有表达功能的慢病毒表达载体。 3．获得较高的病毒滴度，为其体内外研究提供基础。
【关键词】：人肝细胞生长因子 DNA重组 慢病毒
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 第一部分 肝细胞生长因子基因重组慢病毒表达载体的构建12-30
• 1、实验材料12-17
• 2、技术路线17-18
• 3、实验方法18-24
• 4、实验结果24-30
• 第二部分 肝细胞生长因子基因在细胞中的表达30-45
• 1、实验材料30-32
• 2、技术路线32-33
• 3、实验方法33-40
• 4、实验结果40-45
• 讨论45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-51
• 综述51-58
• 参考文献55-58
• 致谢58-59
• 附录59-62

【共引文献】

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1 杨宇;陈建英;张如俊;;肝细胞生长因子对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠炎症因子的影响[J];广东医学;2014年13期

2 刘珍君;王俊贤;张如俊;何忠开;陈建英;;气道内滴注肝细胞生长因子对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠的干预研究[J];岭南心血管病杂志;2014年05期

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1 邢伟;谷氨酰胺对急性肺损伤大鼠组织修复的影响[D];中南大学;2013年

2 申冠洋;血清HGF、TGF-β1水平与脑动脉粥样硬化关联研究[D];新乡医学院;2014年

本文编号：729554