抗菌肽MetalnikowinⅡ对禽多杀性巴氏杆菌ptfa蛋白免疫效果的研究

发布时间：2017-08-24 06:08

  本文关键词：抗菌肽MetalnikowinⅡ对禽多杀性巴氏杆菌ptfa蛋白免疫效果的研究

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【摘要】：抗菌肽是指氨基酸数目小于100，带正电荷，并具有广谱抗性及热稳定性的一类小肽。鉴于抗菌肽良好的抗菌活性，目前抗菌肽主要应用于抗菌和防腐，近年来抗菌肽被发现具有免疫佐剂的潜力，并且已经得到证实。本文以人工合成的抗菌肽MetalnikowinII（Met）作为免疫佐剂，，研究其对禽多杀性巴氏杆菌ptfa蛋白的免疫佐剂效果。 本文通过PCR法扩增ptfa基因片段，用限制性内切酶BamHⅠ、HindIII分别对pET32a质粒及ptfa基因片段进行双酶切，用T4DNA连接酶连接ptfa基因片段与pET32a获得重组质粒pET32a-ptfa， CacL2法转入BL21感受态细胞中，IPTG诱导表达，表达蛋白经SDS-PAGE电泳进行鉴定，采用镍柱纯化，纯化后的ptfa蛋白浓度为140mg/L，冰箱放置备用。 1日龄非免疫雏鸡随机分为6组，分别为蜂胶佐剂+ptfa蛋白、Met0.2mg++ptfa蛋白+弗氏佐剂组（以下简称Met0.2）、Met0.4mg+ptfa蛋白+弗氏佐剂组、Met0.6mg+ptfa蛋白+弗氏佐剂组、ptfa蛋白+弗氏佐剂组及生理盐水对照组。21日龄时首免，试验组注射相应乳化疫苗（0.4ml/只），对照组肌肉注射等量生理盐水，42日龄时二免，于一免后7d、14d、21d、28d、35d、42d进行翼下静脉采血，静脉血室温放置，分离血清，-20℃放置备用，并用二免后7d、14d、21d采集外周血进行MTT试验。通过ELISA试验检测静脉血清中特异性抗体效价，MTT试验检测鸡体内淋巴细胞转化率，分析ELISA及MTT试验结果进而评定Met对ptfa蛋白在鸡体内免疫效果的影响。 本试验成功表达ptfa蛋白并进行纯化，免疫试验结果表明各实验组在二免第二周抗体水平达到最高，各组抗体水平相对于同时期的对照组都较高，且差异显著（P0.05），在一免后的三周内，各组抗体水平呈上升趋势，Met0.4组抗体水平最高，Met0.6组次之，一免之后第三周蜂胶佐剂组与生理盐水组差异不显著（P0.05）。在二免之后Met0.2、弗氏佐剂组之间抗体水平接近，Met0.4与Met0.6组抗体水平明显高于其他三组，Met0.4组血清抗体效价在二免后第二周达到最大值，其抗体效价为1：51200，表明Met作为佐剂对鸡的体液免疫起到一定的效果，0.4mg为最佳佐剂剂量。MTT试验结果表明在二免第二周各实验组均达到最大值，且与生理盐水对照组相比都有显著提高，Met0.4、Met0.6组与弗氏佐剂组差异极显著（P0.01），Met0.2组与弗氏佐剂组之间差异显著（P0.05），Met0.4组与Met0.6组之间差异显著（P0.05），因此结果表明Met0.4可以更有效的促进淋巴细胞转化，抗菌肽Met可以有效的促进淋巴细胞转化，综合判断Met可以在一定程度上促进雏鸡的细胞免疫应答。本试验以ptfa蛋白为抗原，抗菌肽Met作为佐剂证明抗菌肽Met具有良好的免疫佐剂效果，为现代新型免疫佐剂的研究奠定了基础。
【关键词】：禽多杀性巴氏杆菌ptfa蛋白 原核表达 免疫佐剂 抗菌肽MetalnikowinII
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411;Q51
【目录】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-9
• 第1章 绪论9-23
• 1.1 抗菌肽的概述9
• 1.2 抗菌肽的分类9-10
• 1.2.1 抗菌肽根据来源分类9
• 1.2.2 根据不同结构分类9-10
• 1.3 抗菌肽的生物学活性10-12
• 1.3.1 抗细菌活性10-11
• 1.3.2 抗真菌活性11
• 1.3.3 抗原虫活性11
• 1.3.4 抗病毒活性11
• 1.3.5 抗肿瘤活性11-12
• 1.3.6 在先天性免疫及获得性免疫中的作用12
• 1.4 抗菌肽的抗菌机制12-14
• 1.4.1 抗菌肽胞外杀菌机制12-13
• 1.4.2 抗菌肽胞内杀菌机制13-14
• 1.5 免疫佐剂的概述14-15
• 1.6 免疫佐剂的研究进展15-21
• 1.6.1 铝盐佐剂15-16
• 1.6.2 MF59 佐剂16
• 1.6.3 细胞因子佐剂16-18
• 1.6.4 CpG-ODN 佐剂18
• 1.6.5 纳米粒子佐剂18-19
• 1.6.6 天然免疫佐剂19-20
• 1.6.7 抗菌肽免疫佐剂20-21
• 1.7 本试验研究意义及试验内容21-23
• 第2章 ptfa 蛋白的原核表达及纯化23-37
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 试验用菌株及原核表达载体23
• 2.1.2 主要试剂、酶及其试剂盒23
• 2.1.3 试验仪器23-24
• 2.1.4 主要溶液及培养基的配置24-25
• 2.2 试验方法25-31
• 2.2.1 从基因文库中提取质粒及分析25
• 2.2.2 ptfa 基因的 PCR 扩增25-26
• 2.2.3 PCR 产物电泳检测及胶回收26-27
• 2.2.4 ptfa 基因扩增片段进行胶回收27
• 2.2.5 碱裂解法 pET32a 质粒的提取27-28
• 2.2.6 pET32a 载体与目的基因双酶切及胶回收28
• 2.2.7 pET32a-ptfa 重组载体构建28
• 2.2.8 大肠杆菌感受态制备及 pET32a-ptfa 重组子的转化及筛选28-29
• 2.2.9 pET32a-ptfa 重组质粒的原核表达及纯化29-31
• 2.3 结果与分析31-35
• 2.3.1 基因文库中的重组质粒提取及酶切鉴定结果31-32
• 2.3.2 目的基因 PCR 扩增结果32-33
• 2.3.3 pET32a-ptfa 重组质粒双酶切鉴定结果33-34
• 2.3.4 SDS-PAGE 电泳结果34
• 2.3.5 镍柱纯化后蛋白电泳图34-35
• 2.4 讨论35-37
• 第3章 抗菌肽 Met 对 ptfa 蛋白的免疫效果检测37-46
• 3.1 试验材料37-38
• 3.1.1 试验动物37
• 3.1.2 主要试剂37
• 3.1.3 本试验所用主要仪器37
• 3.1.4 主要溶液及试剂配制37-38
• 3.2 试验方法38-41
• 3.2.1 试验动物分组及免疫试验38-39
• 3.2.2 琼脂扩散试验39
• 3.2.3 静脉血采集及血清分离39
• 3.2.4 外周血采集39
• 3.2.5 抗原包被浓度的确定39-40
• 3.2.6 鸡静脉血清特异抗体检测40
• 3.2.7 外周血淋巴细胞增殖试验40-41
• 3.3 结果与分析41-44
• 3.3.1 抗原包被浓度及血清稀释浓度的确定41-42
• 3.3.2 雏鸡静脉血特异抗体检测42-43
• 3.3.3 淋巴细胞转化试验43-44
• 3.4 讨论44-46
• 第4章 结论46-47
• 4.1 pET32a-ptfa 重组载体的原核表达及蛋白纯化46
• 4.2 抗菌肽 Met 对 ptfa 蛋白的免疫效果监测46-47
• 参考文献47-53
• 缩略语词汇表53-54
• 致谢54-55
• 攻读硕士学位期间研究成果55

【参考文献】

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1 吴江漫;陈辉;盛子洋;王娟;范东瀛;高娜;安静;;GM-CSF在登革热病毒和丙型肝炎病毒DNA疫苗诱导的免疫应答中的作用[J];病毒学报;2012年03期

2 刘倚帆;徐良;朱海燕;张立可;汪以真;;抗菌肽与抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的体外协同抗菌效果研究[J];动物营养学报;2010年05期

3 王永林;武勇;赵卓;;新型纳米佐剂用于口蹄疫O型、Asia Ⅰ型双价灭活疫苗的研究[J];中国畜牧兽医;2010年05期

4 谢秀兰;杨发龙;李阳友;马小明;岳华;;鸭瘟强毒株和疫苗株对雏鸭IFN-γ基因表达的影响[J];中国畜牧兽医;2011年11期

5 李宏胜;罗金印;王旭荣;李新圃;杨峰;郁杰;徐继英;严作廷;;不同佐剂的奶牛乳房炎多联苗对小鼠免疫机能的影响研究[J];中国畜牧兽医;2013年01期

6 陈宇;郑纯威;陈国江;张文娟;李端杨;胡松华;;人参皂苷Rg1免疫佐剂作用的研究[J];军事医学科学院院刊;2009年03期

7 赵飞骏;张晓红;刘双全;曾铁兵;余坚;张跃军;顾伟鸣;陈曦;吴移谋;;壳聚糖纳米包裹的IL-2与TpGpd核酸疫苗联合免疫后对Tp感染兔皮肤前后的免疫效应评估[J];中国科学:生命科学;2013年02期

8 张兰廷;刘忠渊;张富春;;抗菌肽结构与功能关系及分子改造研究进展[J];生物技术;2008年05期

9 邱晓燕,刘艳,陈小麟,陈奕欣;舍蝇抗菌肽的提取及其对肿瘤细胞生长的抑制作用[J];中华卫生杀虫药械;2003年01期

10 孙梯业;颜伟;刘全达;张娜;贾洪琳;段伟宏;周宁新;;CpG ODN增强树突状细胞对胃癌细胞增殖周期和凋亡影响的实验研究[J];中华临床医师杂志(电子版);2011年01期

本文编号：729623