miR-125b通过Cbfβ调节间充质干细胞成骨分化的分子机制研究

发布时间：2017-08-24 06:45

  本文关键词：miR-125b通过Cbfβ调节间充质干细胞成骨分化的分子机制研究

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【摘要】：研究背景及目的： MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的、不编码的RNAs，长约21－24核苷酸，在体内代谢和干细胞定向分化过程中发挥重要作用。miRNA通过与其靶mRNA分子的3' UTR互补结合,并对其翻译抑制和直接降解,从而对其表达进行负性调控。近有研究认为，干细胞未分化的某些基因和其谱系特异性基因的保持和激活是通过miRNA的下调来实现的，从而被miRNA调节成骨、成软骨等定向分化。MicroRNA-125b (miR-125b)是最早发现的miRNAs之一，在调控许多细胞增殖和分化中起重要作用。 骨髓间充质干细胞（BMSCs）主要存在于机体骨髓中，其潜能为自我更新及定向分化。在BMSCs向成骨细胞分化过程中有多种调节机制，并且研究证明这个分化过程中有不同种类的因子参与。 有文献报道提示miR-125b可能是MSC向成骨细胞分化过程中的一个重要调节因子，结合前期实验，明确了Cbfβ是miR-125b的靶基因之一，但miR-125b通过Cbfβ调节MSC成骨分化的机制还需深入研究。因此，本课题研究主要是证实在MSC成骨分化过程中miR-125b通过靶向结合Cbfβ的调控作用，初步探索miR-125b通过靶向Cbfβ调节MSC成骨分化的分子机制。 方法： 1.为探明Cbfβ调节间充质干细胞成骨分化的效果，我们构建了Cbfβ人工miRNA（artificialmicroRNACbfβ，amir-Cbfβ）干扰载体，并转染C3H10T1/2细胞形成稳定细胞株。以空载体为对照组，amir-Cbfβ干扰载体为实验组，进行BMP-2诱导后3天检测Cbfβ、Runx2和ALP表达，观察amir-Cbfβ对Cbfβ的抑制作用和对成骨分化的调控作用。 2.以miR-125b为研究对象，在C3H10T1/2细胞成骨分化过程中用qRT-PCR检测miR-125b相对表达量，从而进一步验证本课题组前期基因芯片的结果。以成骨诱导细胞为实验组，未诱导细胞为对照组，培养1、3、5天，分析两组三个时间点miR-125b表达差异。 3.以Cbfβ、Runx2、成骨标志基因ALP、OCN、OPN及成脂基因PPAR-γ为研究对象，，在被BMP-2处理后的C3H10T1/2细胞中分别转染miR-125b mimic、miR-125binhibitor和阴性对照，在1、7、14天分别行qRT-PCR和Western-Blot检测Cbfβ、Runx2、成骨基因ALP、OC、OPN及成脂基因PPAR-γ表达量变化，观察miR-125b作用Cbfβ后对Runx2、成骨基因ALP、OC、OPN及成脂基因PPAR-γ的调控作用。 4.为了验证成骨标志基因ALP、OC、OPN的Western-Blot和qRT-PCR结果，我们分别将C3H10T1/2细胞和C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞进行了ALP活性检测和茜素红染色。 研究结果： 1. Cbfβ人工miRNA干扰载体的构建和稳定细胞株获得及鉴定：amir-Cbfβ干扰载体构建成功并转染C3H10T1/2细胞形成稳定细胞株系，经BMP-2诱导3天后用Western-Blot和qRT-PCR检测Cbfβ、Runx2和ALP蛋白和mRNA的表达，其结果是转染干扰载体的较阴性对照的低。 2. qRT-PCR检结果显示：实验组中miR-125b表达量较对照组明显降低（P0.05）。 3. qRT-PCR和Western-Blot结果显示：在BMP-2处理后的C3H10T1/2细胞中转染miR-125b mimic，Cbfβ、Runx2、ALP、OC、OPN蛋白和mRNA表达量早期（0天、7天）明显降低，而成脂基因PPAR-γ则升高；用同样的方式转染miR-125b inhibitor抑制miR-125b，Cbfβ、Runx2、ALP、OC、OPN mRNA和蛋白表达量早期（0天、7天）明显升高，而成脂基因PPAR-γ则降低。两组对14天检测的变化不明显。实验重复3次，结果有统计学意义（P0.05）。 4. ALP活性检测和茜素红染色：在C3H10T1/2细胞和C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞中用BMP-2诱导后分别转染miR-125b mimic和miR-125b inhibitor，14天检测ALP活性，转染miR-125b inhibitor的较转染miR-125b mimic的高，实验重复3次，结果有统计学意义（P0.05）；茜素红染色检测钙结节，钙结节数由多到少为：miR-125binhibitor、Control、miR-125b mimic。 结论： 构建的amir-Cbfβ干扰载体可抑制Cbfβ的表达，并降低Runx2和ALP的表达，还成功获得了稳定细胞株系。在小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化后miR-125b表达量逐渐降低。在早期成骨分化（0天、7天）中miR-125b通过靶向Cbfβ而负性调节成骨标示基因ALP、OC、OPN蛋白及mRNA的表达，并正性调节成脂基因PPAR-γ蛋白及mRNA的表达。
【关键词】：miRNA miR-125b Cbfβ amir-Cbfβ amiRNAs 间充质干细胞 Runx2
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 Cbfβ人工 miRNA 干扰载体的构建及稳定细胞株的获得及鉴定15-28
• 2.1 材料与方法15-21
• 2.2 结果21-25
• 2.3 讨论25-27
• 2.4 小结27-28
• 第三章 miR-125b 通过 Cbfβ调节 C3H10T1/2 细胞成骨分化28-47
• 3.1 材料与方法28-35
• 3.2 结果35-43
• 3.3 讨论43-45
• 3.4 小结45-47
• 全文总结47-48
• 参考文献48-52
• 文献综述52-58
• 参考文献56-58
• 攻读学位期间发表的论文58-59
• 致谢59

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本文编号：729818