肺炎链球菌StkP蛋白疫苗研究

发布时间：2017-08-24 07:13

  本文关键词：肺炎链球菌StkP蛋白疫苗研究

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【摘要】：肺炎链球菌会在鼻咽部、支气管或者肺内定殖并引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症等疾病，在老年人和儿童中发病率较高。但近些年来肺炎链球菌的耐药性与多种血清型的问题，使得研制疫苗成为预防其感染的主要手段。世界卫生组织推荐使用上市的肺炎荚膜多糖疫苗和肺炎多糖-蛋白结合疫苗预防肺炎链球菌感染。然而现存疫苗由于覆盖的血清型有限、保护人群具有限制性，使得研制蛋白疫苗的成为重要方法。本论文利用原核表达系统构建肺炎链球菌StkPC314蛋白，评价其作为疫苗候选的免疫原性和免疫保护性。 本论文选用肺炎链球菌丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Serine-Threonine kinaseprotein，StkP）C末端截短314为氨基酸作为蛋白疫苗，命名为StkPC314。将StkPC314基因进行大肠杆菌密码子优化，，设计合成StkP截短的基因序列后，通过分子克隆构建表达质粒pET20b-stkpC314，使其在大肠杆菌BL21中表达蛋白。将表达并纯化的后高纯度的StkPC314蛋白免疫小鼠，以间接ELISA实验检测到高滴度的小鼠血清多抗，说明StkPC314具有较高免疫原性。然后建立肺炎链球菌的小鼠腹腔感染模型，通过免疫保护实验对StkPC314免疫保护性进行了初步评价。此实验还确定了最适免疫蛋白剂量为20μg/只，最适免疫佐剂为弗氏佐剂。小鼠肺炎链球菌攻毒模型说明StkPC314蛋白有较高免疫原性和免疫保护性，作为蛋白疫苗候选具有很大的潜力。 为建立StkPC314免疫蛋白原的精确定量方法，本论文通过杂交瘤细胞技术筛选出5株能够分泌特异性StkPC314单克隆抗体的杂交瘤细胞，经培养、收集、纯化得到高纯度的单克隆抗体，对单克隆抗体进行相对亲和力分析、结合位点的分析、Ig亚类分型等分析。以5株混合单抗作为标准品，建立间接ELISA方法检测小鼠抗血清含量，能够对OD450nm为0.3-1.3范围内的小鼠多抗血清进行精确定量。为建立有效的抗原蛋白StkPC314检测方法，将单克隆抗体进行生物素化标记后，与兔多抗联合建立双抗夹心ELISA方法，实现对抗原StkPC314蛋白精确定量，精确的抗原定量范围是12.2-97.6ng/ml，抗原蛋白StkPC314的最低检测线是12.2ng/ml。
【关键词】：肺炎链球菌 StkP 双抗夹心ELISA McAb 疫苗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 缩略词表7-10
• 第一章 前言10-21
• 一 肺炎链球菌与肺炎疫苗10-15
• （一）肺炎链球菌简介10-12
• （二）肺炎链球菌疫苗12-15
• 二 肺炎链球菌 STKP 蛋白疫苗候选15-17
• （一）StkP 蛋白的结构15-16
• （二）StkP 蛋白在肺炎链球菌细胞分裂中的作用16
• （三）stkp 基因敲除对肺炎链球菌的影响16-17
• （四）StkP 截短蛋白疫苗的研究进展17
• 三 ELISA 检测方法17-19
• （一）单克隆抗体技术17-18
• （二）免疫酶技术与 ELISA18-19
• 四 论文设计19-21
• （一）论文目的19
• （二）实验设计19-21
• 第二章 肺炎链球菌 STKP 重组蛋白疫苗的评价研究21-46
• 一 材料、试剂与仪器21-25
• （一）菌株、质粒、毒株21
• （二）酶及试剂盒21-22
• （三）主要试剂22
• （四）溶液的配制22-25
• （五）主要仪器25
• 二 实验方法25-30
• （一）重组表达质粒 pET20b-stkp~（C314）的构建25-27
• （二）StkP~（C314）蛋白的表达、纯化27-28
• （三）StkP~（C314）蛋白 Western-Blotting 检测28
• （四）StkP~（C314）蛋白疫苗的免疫原性评价28-29
• （五）StkP~（C314）蛋白疫苗的免疫保护性29-30
• 三 实验结果30-44
• （一）重组蛋白 StkP~（C314）基因片段的设计30-31
• （二）重组表达质粒 pET20b-stkp~（C314）4的构建31-33
• （三）StkP~（C314）蛋白的表达、纯化与兔多抗 Western-Blotting 验证33-39
• （四）StkP~（C314）蛋白疫苗的免疫原性评价39-40
• （五）StkP~（C314）蛋白疫苗的免疫保护性研究40-44
• 四 讨论44-46
• 第三章 STKP~（C314）蛋白单克隆抗体的制备与 ELISA 检测方法的建立46-63
• 一 材料、试剂46-47
• （一）细胞、实验动物46
• （二）试剂配制46-47
• 二 实验方法47-53
• （一）StkP~（C314）蛋白单克隆抗体的制备47-51
• （二）间接 ELISA 小鼠血清多抗定量方法的建立51
• （三）StkP~（C314）抗原定量方法的建立51-53
• 三 实验结果53-62
• （一）StkP~（C314）蛋白单克隆抗体的制备53-57
• （二）间接 ELISA 小鼠血清多抗定量方法的建立57-58
• （三）双抗夹心 ELISA 抗原定量方法的建立58-62
• 四 讨论62-63
• 结论63-64
• 附录 164-67
• 参考文献67-72
• 作者简介72-73
• 致谢73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：729906