麦胚抗氧化肽RVF对SH-SY5Y细胞氧化应激的调控及其机理研究

发布时间：2017-10-08 11:08

  本文关键词：麦胚抗氧化肽RVF对SH-SY5Y细胞氧化应激的调控及其机理研究

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【摘要】：氧化应激是引起许多慢性疾病的主因之一。神经细胞承担着人类思考和活动的责任,新陈代谢较快,而其细胞内抗氧化酶的表达相对较低,所以易受氧自由基攻击。虽然目前已有一些报道证实麦胚活性多肽在体内外具有一定的抗氧化能力,但大部分研究还局限于体外自由基清除效果的检测或传统的动物实验方面,缺乏抗氧化肽在细胞、分子水平机制的研究。因此,本论文将采用H202作为氧化应激的诱导剂,以人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y作为研究载体,较深入地探讨麦胚抗氧化肽RVF (Arg-Val-Phe)的抗氧化机制,可为其在缓解氧化应激、预防神经退行性疾病等领域的应用提供重要的理论依据,也可为麦胚资源的综合利用提供新的途径。论文选择分离纯化获得再固相合成的麦胚抗氧化肽作为研究对象,通过H202诱导建立了SH-SY5Y细胞氧化损伤模型,从细胞成活率、细胞形态观察了RVF对H202诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用,结果表明200 μmol/L RVF预孵育12h后可将细胞成活率提高21.97%,细胞由皱缩状恢复为细长的梭状,形态上得到显著改善。通过流式细胞术考察了细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平,采用比色法测定了细胞内丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量,结果表明RVF预处理后能有效抑制细胞内ROS水平的上升,100、150、200 μmol/L的RVF可将细胞内ROS水平从9.97±12.13%(p0.01)降至5.72±17.83%(p0.01)、4.21±18.29%(p0.01)、2.54±37.00%(p0.01)；并显著地降低细胞内的MDA含量,200 μmol/L RVF可将H202作用组MDA的含量从2.74±8.63%(p0.01)下降至1.35±16.60%(p0.01)。采用Annexin V/PI双染法检测了细胞凋亡率,研究表明RVF干预组SH-SY5Y细胞凋亡率显著降低,100、200、250μmol/L RVF干预组对应的细胞凋亡率分别为39.44%±8.75%(p0.05)、16.34%±4.16%(p0.01)、10.47%±5.06%(p0.01)。采用蛋白免疫印迹(Western blot)考察了有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路蛋白磷酸化激活,研究表明RVF可以抑制H202诱导MAPK的磷酸化激活,缓解细胞氧化应激带来的凋亡。通过流式细胞术检测了线粒体膜电位,结果表明RVF可恢复线粒体跨膜电位,在100、150、200μmol/L浓度下可将线粒体阴性细胞比例从92.58%±9.4%(p0.01)分别降至85.98%±8.6%(p0.01)、67.13%±7.4%(p0.01)、44.58%±5.32%(p0.01)；采用蛋白免疫印迹考察了SH-SY5Y细胞内线粒体凋亡通路蛋白Bax/Bcl-XL的含量变化、Cytochrome C(Cyt C)的释放及caspase 3% poly ADP-ribose poly-merase (PARP)的剪切情况,研究发现H202可以促进线粒体膜上Bcl-XL的降解以及Bax的聚集,且在12h时可使Cyt C的释放达到饱和；而经RVF预孵育后能够显著增强Bcl-XL在线粒体上的稳定性、抑制Bax在线粒体上的聚集,同时减弱了Cyt C的释放；RVF还进一步抑制了caspase-3的激活及其对底物PARP的切割。研究结果表明麦胚抗氧化肽RVF可通过抑制H202诱导的神经细胞的凋亡来发挥对氧化应激的保护作用,其保护机制可能涉及维持线粒体跨膜电位、增加抗凋亡蛋白的表达及阻止线粒体通路的激活等。
【关键词】：麦胚抗氧化肽 人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y 氧化应激 凋亡
【学位授予单位】：长沙理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 绪论11-20
• 1.1 氧自由基与氧化应激11-14
• 1.1.1 体内氧自由基的产生11-12
• 1.1.2 氧自由基对人体的危害12-13
• 1.1.3 氧化应激与神经退行性疾病13-14
• 1.1.4 氧自由基的清除14
• 1.2 麦胚蛋白和抗氧化肽的研究现状14-16
• 1.2.1 麦胚与麦胚蛋白14-16
• 1.2.2 麦胚生物活性肽研究进展16
• 1.3 课题立项依据和研究内容16-20
• 1.3.1 立项背景及意义16-17
• 1.3.2 课题主要研究内容17-20
• 第二章 RVF对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激的保护作用20-32
• 2.1 材料与仪器20-21
• 2.1.1 材料与试剂20-21
• 2.1.2 主要仪器与设备21
• 2.2 实验方法21-24
• 2.2.1 麦胚抗氧化肽的合成21-22
• 2.2.2 细胞培养相关试剂的配制22
• 2.2.3 细胞复苏、培养与传代、冻存22-23
• 2.2.4 H_2O_2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型的建立23
• 2.2.5 RVF对H_2O_2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用23-24
• 2.2.6 数据统计与分析24
• 2.3 结果与讨论24-31
• 2.3.1 H_2O_2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型的建立24-25
• 2.3.2 RVF对SH-SY5Y细胞成活率的影响25-26
• 2.3.3 RVF对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用26-31
• 2.4 本章小结31-32
• 第三章 RVF对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞线粒体凋亡通路的影响32-52
• 3.1 材料与仪器32-33
• 3.1.1 材料与试剂32-33
• 3.1.2 主要仪器与设备33
• 3.2 实验方法33-35
• 3.2.1 细胞培养与分组33
• 3.2.2 Annexin V/PI双染对SH-SY5Y细胞凋亡率的检测33
• 3.2.3 细胞膜电位的测定33-34
• 3.2.4 Western blot对细胞MAPK通路激活的考察34
• 3.2.5 Western blot对细胞线粒体凋亡通路的考察34
• 3.2.6 蛋白浓度的测定34
• 3.2.7 数据统计与分析34-35
• 3.3 结果与讨论35-50
• 3.3.1 RVF对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率的影响35-36
• 3.3.2 RVF对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞MAPK通路的影响36-39
• 3.3.3 RVF对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞线粒体凋亡通路的影响39-50
• 3.4 本章小结50-52
• 第四章 结论与展望52-55
• 4.1 主要结论52-53
• 4.2 创新点53
• 4.3 展望53-55
• 参考文献55-66
• 致谢66-67
• 附录A67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 郑天胜;李翔;;线粒体凋亡通路的研究进展[J];医学综述;2013年18期

2 谭纪萍;刘瑛;王鑫;王鲁宁;;中国人口老龄化发展趋势与老年健康研究现状[J];中国老年学杂志;2012年19期

3 冯阳;刘建军;黄钢;;线粒体膜通透性转换孔结构与功能研究进展[J];上海交通大学学报(医学版);2012年03期

4 施传信;宋e，

本文编号：993665